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O que é RT-qPCR

  • É uma tecnologia de PCR em Tempo Real (qPCR) é uma evolução do método de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase). Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.

 

  • A PCR foi desenvolvida no final dos anos 80 por Kary Mullis que posteriormente ganhou o Prêmio Nobel de Química pelo feito. Além de revolucionar as técnicas de genética molecular, sua aplicação compreende várias áreas como identificação genética, medicina forense, análises clínicas, diagnóstico de doenças, controle de qualidade industrial, entre outros.

 


Sensibilidade/Especificidade XGEN

Esse kit segue o protocolo CDC Chinês, onde avalia 2 genes específicos para vírus SARS-CoV-2, genes reguladores e nucleocapsídeo.

É preparado materiais para reação, inicia o processo na amplificação: Um ciclo de variadas temperaturas onde há desnaturação, anelamento e extenção da fita do ácido nucleico, que resumidamente é chamado de “Ct” . Como há dobra do produto a cada Ct, a curva desenhada é exponencial (aspecto de “S”). Quanto menor o Ct de início de visualização da curva, maior é a carga viral.


Possibilidade de resultados

• Não detectado

• Não foram detectados materiais genéticos do vírus SARS-CoV-2 na amostra analisada.

• Detectado

• Foram detectados materiais genéticos do vírus SARS-CoV-2 na amostra analisada (Gene N e ORF1ab).

• Inconclusivo/Indeterminado

• Foi detectado somente Gene N do vírus SARS-CoV-2 na amostra analisada (não é considerado negativo para coronavírus).

• Obs: Alguns serviços consideram detecção isolada do Gene N isolado é considerado como positivo para SARS-CoV-2.


XGEN Master Covid-19 – Princípio do Teste

A detecção é feita no formato RT-qPCR onde a transcrição reversa e a subsequente amplificação da sequência alvo específica ocorrem no mesmo poço de reação.

O alvo de RNA isolado é transcrito gerando DNA complementar pela transcriptase reversa que é seguida pela amplificação de uma região conservada dos genes ORF1ab e N para SARS-CoV-2 usando iniciadores específicos e uma sonda marcada com fluorescência.

A presença de uma sequência específica do patógeno na reação é detectada por um aumento na fluorescência observada a partir da sonda correspondente duplamente marcada, e é relatado como o valor limiar de ciclo (Ct) pelo termociclador em Tempo Real.


Indicações e Interferências no resultado

Indicações: 

  • Escolha “Padrão ouro” para diagnós5co COVID-19;
  • Exame mais precoce na detecção;
  • Pode detectar no início dos sintomas;
  • Ideal entre terceiro e sétimo dia de sintomas;
  • “Controle de cura”.

Fatores que interferem no resultado: 

  • Coletas precoces ou tardias;
  • Procedimento de coleta;
  • Tipos de amostras (trato aéreo superior e inferior, fezes);
  • Diluição das amostras (volume em meio de transporte);
  • Estabilidade da amostra (refrigerado e congelado se maior que 24h).


A detecção pode variar dentro do mesmo paciente

 

Esse belo estudo demostra a cinética da carga viral de nove pacientes onde pode se observar o comportamento da detecção ou não do vírus por RT-PCR em diferentes dias e sítios de coleta. Observe por exemplo na figura c, que ao longo de 22 dias é observado resultados detectados e não detectados (linha amarela – inferior). Normalmente tem se observado isso em maiores Ct ou carga viral menor.


Prolongado tempo de derramamento viral do SARS-CoV-2 (COVID-19)

 

  • É observado, além da variância positivo/negativo, a persistência, em alguns casos, de “derramamento viral” por períodos prolongados, com relatos no momento mais de 80 dias.
  • Na maioria desses casos o Ct apresenta maior que 35. Não se sabe até o momento se há transmissibilidade do vírus nesse período.


Prolongado tempo de derramamento viral do SARS-CoV-2 (COVID-19)

 

Podemos tentar estimar a carga viral da amostra utilizando a tabela apresentada por esse belo estudo.

Ex. Na figura acima para o Gene N de Ct = 29 temos em torno de Log de 5 na base 10 (100.000 cópias por reação) e para Gene ORF1ab Ct=27 de log de 6 na base 10 (1.000.000 cópias por reação).

 

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